Biuretreaktion

= Nachweis von Polypeptiden/Tripeptiden
Prinzip:
Im stark alkalischen Bereich reagieren Peptidbindungen (Säureamidgruppen) mit einer Kupfersulfatlösung und zeigen eine charakteristische dunkel blau-violette Färbung. Dabei wird Cu++ zum Zentralatom des Farbkomplexes, der sich aber nur in Gegenwart von Peptidbindungen beziehungsweise mindestens 2 Säureamidgruppen bildet. Diese Nachweismethode ist sehr unspezifisch, da zum Beispiel Tyrosinreste ebenfalls mit Cu-Ionen komplexieren und zu einem Farbkomplex beitragen. Die Nachweisgrenze liegt bei 1-10µg Proteine/ml. Aminosäuren zeigen keine positive Reaktion, denn sie binden das Kupfer nur chelartartig (ohne Farbkomplex).

Reaktionsgleichung Biuret

Versuch:
Für den nachfolgenden Versuch können die hier aufgelisteten Proben und deren Probenvorbereitung eingesetzt werden:

• Eiklar (auf 100 ml mit ention. H2O auffüllen und durch Faltenfilter filtrieren)
• Vollmilch
• Suppenwürze (in warmen ention. H2O lösen und durch Faltenfilter filtrieren)
• Blindprobe (ention. H2O)
• Glycinlösung (0,1mol/l)
• Molke
• Tofu (zerkleinern)
• Sojamilch
• Naturjoghurt
• Nägel
• Haare - wenn möglich nicht gefärbt (in Eprouvette geben und mit ention. H2O bedecken)

Chemikalien:

• Biuret-Reagenz (1,5 g Kupfersulfat Pentahydrat und 6 g Seignettesalz in 500 ml ention. Wasser lösen, 300 ml 1% Natronlauge zugeben und anschließend die Mischung mit ention. Wasser auffüllen.)
• Alternativ zum Biuret-Reagenz:

 Natronlauge NaOH (2mol/l)
Kupfersulfat CuSO4 (5%)

Entsorgung: Schwermetalle

Gefahrenhinweise:

• Natronlauge: ätzend

• Kupfersulfat: reizend, Umweltgefährlich

Geräte:

• Eprouvetten und Eprouvettenständer
• Kolbenhubpipette oder normale Pipette mit Pipettierhilfe
• Spritzflasche

Durchführung
1 ml der Probe (oder bei festen Proben einen halben Spatel voll mit ca. 2ml ention. H2O bedecken) wird in einer Eprouvette mit 1 ml der Biuret-Reagenz versetzt, oder alternativ: Probe wird mit 1 ml NaOH und 0,5 ml Kupfersulfatlösung versetzen.
Die Reaktion ist positiv, wenn es zu einer deutlichen dunkel blau-violetten Färbung kommt.
Zur besseren Ablesung der Ergebnisse ist eine Blindprobe (anstatt der Probe wird 1 ml ention. Wasser verwendet) zu empfehlen.

Tipps:
Generell ist die Probenmenge nicht ausschlaggebend für den Versuch, so braucht man bei den Proben Tofu, Naturjoghurt, Nägel und Haare die Eprouvette nur auf ca. 2-3 ml auffüllen.
Es ist ratsam die Proben nicht nur mit dem Biuret-Reagenz zu versetzen, sondern auch die Alternativ-Methode durchzuführen, da mit dieser oft bessere und eindeutigere Ergebnisse erzielt werden.

Ergebnis:

Ergebnis/Interpretation:
Nach Zugabe des Biuret-Reagenz zeigte sich nicht bei allen Proben die erwünschte Blaufärbung. Bei der alternativen Version mit NaOH und CuSO4 wurden die positiven Ergebnisse besser erkennbar.
Vollmilch und das Eiklar haben Peptidbindungen und sind deshalb intensiv dunkel blau-violett gefärbt und somit positiv. Bei der Glycinlösung hat sich ein leichter Komplex gebildet, obwohl Glycin eigentlich negativ sein sollte. Möglicher Grund ist eine Verunreinigung des Glycins durch Peptide. Bei der Blindprobe bildet sich wie zu erwarten war, kein Komplex. Es erfolgt lediglich eine leichte hellblau Färbung aufgrund des Kupfersulfates.